Ácidos borônicos alternativos na detecção de Micolactona A/B utilizando cromatografia em camada delgada (f

BMC Infectious Diseases volume 23, número do artigo: 495 (2023) Citar este artigo

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Mycobacterium ulcerans é o agente causador da úlcera de Buruli. A patologia da doença de M. ulcerans foi atribuída à secreção de uma potente citotoxina macrólida conhecida como micolactona, que desempenha um papel importante na virulência da doença. A micolactona é um biomarcador para o diagnóstico de BU que pode ser detectado pela técnica de cromatografia em camada fina fluorescente (f-TLC). A técnica baseia-se na derivatização química da micolactona A/B com ácido 2-naftilborônico (BA) que atua como quimiossensor fluorogênico. No entanto, interferências de fundo devido a lipídios de tecidos humanos co-extraídos, especialmente com amostras clínicas, juntamente com a subjetividade do método, exigem uma investigação para encontrar uma alternativa ao BA.

Vinte e seis ácidos arilborônicos comercialmente disponíveis foram inicialmente selecionados como alternativas ao BA usando o experimento f-TLC. Medições UV-vis também foram realizadas para determinar os espectros máximos de absorção da micolactona A/B e dos adutos de ácido micoborônico, seguidas por uma investigação da capacidade de aumento de fluorescência da formação de éster de boronato entre a micolactona A/B e nossos três borônicos mais promissores. ácidos (BA15, BA18 e BA21). A técnica de LC-MS foi empregada para confirmar a formação de aduto entre a micolactona e os ácidos borônicos. Além disso, um estudo comparativo foi conduzido entre BA18 e BA usando 6 amostras de pacientes com BU confirmadas por reação em cadeia da polimerase (PCR).

Três dos ácidos borônicos (BA15, BA18 e BA21) produziram intensidades de banda fluorescente superiores ao BA. Estudos de complexação conduzidos em cromatografia em camada delgada (TLC) usando solução 0,1 M dos três ácidos borônicos e vários volumes de 10 ng/µL de micolactona sintética variando de 1 µL – 9 µL correspondendo a 10 ng – 90 ng deram resultados semelhantes com mico- Aduto BA18 emergindo com as bandas de fluorescência visivelmente mais intensas. Os máximos de absorção UV-vis (λmax) para a micolactona A/B livre foram observados em 362 nm, e os valores para os adutos myco-BA15, myco-BA18 e myco-BA21 foram em 272 nm, 270 nm e 286 nm respectivamente. O λmax experimental comparável de 362 nm para a micolactona A/B ao valor calculado de Woodward-Fieser de 367 nm para a cadeia lateral de ácido graxo da micolactona A/B demonstra que, embora 2 boronatos cíclicos tenham sido formados, apenas o boronato do lado sul a cadeia com o cromóforo foi excitada por irradiação a 365 nm. Experimentos de fluorescência demonstraram que o acoplamento de BA18 à micolactona A/B ao longo dos 1,3-dióis aumentou notavelmente a intensidade de fluorescência em 537 nm. Espectrômetro de Massa de Alta Resolução (HR-MS) foi utilizado para confirmar a formação do aduto mico-BA15. Finalmente, a análise f-TLC de amostras de pacientes com BA18 proporcionou intensidades melhoradas do aduto BA18 em comparação com o aduto BA original.

Vinte e seis ácidos borônicos disponíveis comercialmente foram investigados como alternativas ao BA, utilizados na análise f-TLC para o diagnóstico de BU. Três (3) deles BA15, BA18 e BA21 forneceram perfis de intensidade de banda de fluorescência superiores. Eles forneceram perfis que eram mais fáceis de interpretar após a formação do aduto de ácido micoborônico e em experimentos com amostras clínicas de pacientes com BA18 os melhores. O BA18, portanto, foi identificado como uma alternativa potencial ao BA e poderia fornecer uma solução para o desafio da interferência de fundo de lipídios de tecidos humanos co-extraídos de amostras clínicas atualmente associadas ao uso de BA.

Relatórios de revisão por pares

A micolactona (ML), a primeira citotoxina macrólida conhecida por ser produzida por um patógeno humano Mycobacterium ulcerans (MU), é o agente causador da úlcera de Buruli (BU) [1, 2]. É o único macrólido identificado no gênero Mycobacterium [3]. Em 1965, Connor e colaboradores levantaram a hipótese de que M. ulcerans era responsável pela produção da citotoxina difusível, que foi posteriormente confirmada em porquinhos-da-índia. A injeção de filtrados de cultura micobacteriana no animal experimental resultou em necrose como nas infecções humanas [4,5,6]. A molécula suspeita foi posteriormente isolada, purificada e caracterizada de forma eficaz a partir da porção solúvel em acetona de extratos lipídicos de M. ulcerans em 1999 por George et al. A estrutura química foi posteriormente resolvida como um policetídeo denominado micolactona (ML) [7, 8]. ML foi detectado em cromatografia em camada delgada (TLC) como uma banda lipídica amarela clara, ativa no ultravioleta, com um valor de fator de retenção de 0,23 em clorofórmio/metanol/água (90:10:1, vol/vol/vol) [7]. Um pico proeminente em m/z 765, correspondente ao aduto de sódio da micolactona, foi observado por análise de espectrometria de massa (MS) sob condições de eletropulverização. ML é um macrolídeo de policetídeo híbrido com um anel lactona de 12 membros em seu núcleo, junto com uma cadeia lateral acil poliinsaturada ligada a C5-O numerada C1′-C16′ ao sul e uma cadeia lateral superior ligada a C composta do átomos de carbono C12–C20. Diferentes congêneres de micolactona resultam de diferenças na cadeia “Sul”, enquanto a cadeia “Norte” superior é invariante. Outras pesquisas revelaram que a micolactona obtida de M. ulcerans era uma combinação 3:2 de dois estereoisômeros conhecidos como micolactonas A e B, que se formam como isômeros geométricos espontâneos em torno da ligação dupla em C4′ C5′ (mostrada pela linha ondulada entre C5′ e C6′) [9, 10] (Fig. 1).